تستهای مولکولی تشخیصی کووید-۱۹ (COVID-19)(ویرایش ۲، ۹۹/۱/۱۴)

 | تاریخ ارسال: ۱۳۹۹/۱/۱۴ | 
ترجمه و تلخیص: گروه علمی پاتولوژی مولکولی و سیتوژنتیک انجمن علمی آسیب شناسی ایران

جهت دریافت فایل پی دی اف مطلب کلیک نمایید.

توجه
این مطلب رویکرد علمی داشته و استفاده از آن در آزمایشگاههای تشخیص مولکولی باید در هماهنگی با دستورالعملها و ابلاغیههای رسمی کشوری باشد. همچنین، لازم به ذکر است که تستهای مولکولی تشخیصی کووید-۱۹ در حال ایجاد، اصلاح و اعتبارسنجی مستمر می­باشند. از همین رو تلاش خواهد شد که نتایج به روز رسانی شده در این زمینه در نسخههای بعدی این مطلب آورده شوند.
 

مقدمه
چندین نوع کرونا ویروس می­توانند انسان را آلوده کنند. تعدادی از آنها منجر به بیماری خفیف می­شوند، در حالیکه برخی نظیر MERS-CoV و SARS-CoV مرگ و میر بالایی دارند. در دسامبر سال ۲۰۱۹، گروهی از بیماران مبتلا به کروناویروس جدید (novel coronavirus, 2019 nCoV) در ووهان، چین مشخص شدند. این ویروس توسط کمیته بین ­المللی طبقه ­بندی ویروسها، SARS-CoV-2  نامگذاری شده است. در این متن از این ویروس با عنوان کووید-۱۹ (COVID-19) نام برده می­شود که نام ترجیحی سازمان بهداشت جهانی است.
 

هدف
هدف از این مطب ارائه راهنمایی به آزمایشگاههای تشخیص مولکولی و ذی­نفعان در رابطه با تستهای مولکولی ویروس COVID-19  است.
 

ایمنی زیستی (BioSafety)
کار با نمونه برای آزمایشهای مولکولی نظیر تعیین توالی یا تست تقویت اسید نوکلئیک (Nucleic Acid Amplification Tests, NAAT) نیاز به امکانات BSL-2 یا معادل آن دارد. تلاش برای کشت ویروس یا تستهای خنثی­ سازی حداقل به امکانات BSL-3 نیاز دارند.
باید از ضد عفونی کننده ­های مناسب با فعالیت اثبات شده در برابر ویروس­های پاکت­­ دار (enveloped) استفاده شود. به عنوان مثال: هیپوکلریت، الکل، پراکسید هیدروژن، و ترکیبات فنلی.
نمونه ­های موارد مشکوک یا تأیید شده باید به عنوان  UN3373(مواد بیولوژیک طبقه B ) و نمونه­ های کشت ویروسی باید به عنوان گروهA ، UN2814 (ماده عفونی، با تأثیر بر انسان) در نظر گرفته شوند.
 

نوع نمونه مناسب برای تستهای مولکولی
جدول شماره ۱ نوع نمونه و زمان نمونه­ برداری را به تفکیک شرایط فرد (بیمار یا فرد در تماس) نشان می­دهد.
 
جدول شماره ۱. نوع نمونه مناسب برای تستهای مولکولی کووید-۱۹

سواب توصیه­ شده، سواب داکرون یا پلی­استر است.
 

بسته­بندی و حمل و نقل نمونه­های بالینی
نمونه­ ها باید در اسرع وقت پس از جمع آوری به آزمایشگاه برسند. نمونه ­هایی که سریعاً به آزمایشگاه تحویل داده می­شوند را می­توان در دمای ۸-۲ درجه سانتیگراد نگهداری و ارسال کرد. هرگاه احتمال تاخیر در ارسال نمونه وجود داشته باشد، استفاده از محیط انتقالی ویروسی (viral transport medium, VTM) حاوی مکملهای ضد قارچ و آنتی ­بیوتیک قویا توصیه می­شود. چنانچه VTM در دسترس نباشد، ممکن است بتوان از سالین استریل استفاده کرد. نمونه­ ها را می­توان در ۲۰- درجه سانتیگراد یا به طور ایده­ آل در ۷۰- درجه سانتیگراد منجمد کرده و روی یخ خشک حمل نمود. اهمیت دارد که که از انجماد و ذوب مکرر نمونه ­ها خودداری شود.
 

تستهای تقویت اسید نوکلئیک (NAAT( برای ویروس کووید-۱۹
تأیید تشخیص بیماران مبتلا بر اساس شناسایی توالی ژنهای منحصر به فرد ویروس با روشهایی نظیر NAAT مانند واکنش زنجیره پلیمراز معکوس در زمان واقعی  (real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction, rRT-PCR) است که می­تواند با تعیین توالی (sequencing) تایید نهایی شود. اسید نوکلئیک مورد استفاده RNA است و ژنهای ویروسی که تاکنون با این روشها مورد هدف قرار گرفته­ اند شامل ژنهایN ،E ،S  و RdRP هستند. به زبان ساده، شناسایی نواحی مختص کووید-۱۹ در این ژنها بیانگر آلودگی فرد با کووید-۱۹ است. شکل شماره ۱، قرارگیری این ژنها در کنار یکدیگر را نشان می­دهد. ژنوم بالایی مربوط به کووید-۱۹ و ژنوم پایینی مربوط به ویروس SARS ‌است.
  
شکل ۱. قرارگیری ژنهای ویروس کووید-۱۹ (نوار آبی بالایی) و تشابه آن با ژنهای ویروس SARS (نوار آبی پایینی). شکل مربوط به بیمارستان Charité برلین می­باشد. همانگونه که مشاهده می­شود، در این روش محل قرارگیری پرایمرهای واکنش زنجیره پلیمراز روی ژنهای E (برای غربالگری اولیه) و RdRp (برای تایید نهایی) است.
 
در حال حاضر، چندین پروتوکل مبتنی بر تستهای مولکولی برای شناسایی کووید-۱۹ معرفی شده­­اند که اطلاعات آنها در سایت FIND (در بخش SARS-COV-2 diagnostic pipeline) در دسترس می­باشد (
https://www.finddx.org)(شکل ۲). برخی از آنها در حال توسعه بوده (in development) و برخی نیز تجاری­سازی شده­اند (commercialized). شایان ذکر است که تعداد قابل توجهی از این روشها دارای تاییدیه CE-IVD هستند.
 

شکل ۲. صفحه اول سایت FIND در بخش COVID-19
 
در ابتدای همه ­گیری کووید-۱۹، تعدادی پروتوکل در برخی آزمایشگاهها توسعه یافتند (in-house) که مشخصات آنها همچنان به طور مجزا در سایت سازمان بهداشت جهانی موجود است (جدول ۲). سازمان بهداشت جهانی تاکید دارد که هیچ یک از این روشها در حال حاضر مورد ترجیح این سازمان نبوده و هیچکدام از آنها توسط این سازمان مورد اعتبارسنجی (validation) قرار نگرفته ­اند. همچنین، اطلاعات مربوط به آنها توسط این سازمان به روز نمی­شود.
 
جدول شماره ۲. خلاصه پروتوکلهای موجود از تستهای مولکولی مبتنی بر NAAT
 
 
تفسیر نتیجه مثبت تستهای تقویت اسید نوکلئیک  )NAAT(
در مناطقی که کووید-۱۹ انتشار دارد، یک نتیجه مثبت به روش rRT-PCR برای تایید تشخیص کافی است.
 

تفسیر نتیجه منفی تستهای تقویت اسید نوکلئیک  )NAAT(
در مناطقی که کووید-۱۹ انتشار دارد، یک یا چند نتیجه منفی احتمال عفونت با کووید-۱۹ را رد نمی­کند. تعدادی از مهمترین عواملی که می­توانند منجر به نتیجه منفی در یک فرد آلوده شوند، به این شرح هستند:
  • پایین یا مقدار اندک نمونه. برای بررسی کیفیت اسید نوکلئیک توصیه می­شود که یک ژن انسانی به طور همزمان به عنوان کنترل روی نمونه تست شود.
  • جمع­ آوری نمونه خیلی زود یا خیلی دیر در سیر بیماری
  • نگهداری یا حمل و نقل نادرست نمونه
  • فنی مانند جهش های ویروسی یا مهارکننده­ های  PCR
در صورتی که نتیجه منفی از بیمار مبتلا با شک بالینی قوی به عفونت با ویروس به دست آید، به ویژه هنگامی که فقط نمونه­ های دستگاه تنفسی فوقانی جمع ­آوری شده باشند، باید نمونه­ های اضافی از جمله از دستگاه تنفسی تحتانی در صورت امکان جمع­ آوری و آزمایش شوند.
 

 توالی ­یابی ژنوم ویروس (viral sequencing) 
علاوه بر تأیید حضور ویروس با روش NAAT، تعیین توالی درصدی از نمونه ­ها در دوره ­های منظم می­تواند برای پایش از جهت ایجاد جهش های تازه در ژنوم ویروسی مفید باشد. این موضوع از این جهت حائز اهمیت است که ایجاد جهش های تازه ممکن است روی عملکردهای متقابل پزشکی از جمله کارایی تستهای تشخیصی و نیز سیر مطالعات اپیدمیولوژیک مولکولی اثر بگذارند. در حال حاضر یکی از منابع معتبری که اطلاعات ژنومیک کووید-۱۹ را گردآوری کرده و در دسترس قرار می­دهد، سایت GISAID (https://www.gisaid.org) می­باشد. شکل ۳، درخت فیلوژنی کووید-۱۹ را با توجه به گذر زمان و در کشورهای درگیر نشان می­دهد. طبق این شکل، ویروس طی زمان و در مکان جغرافیایی دچار جهش و تغییراتی در ژنوم خود شده است که اهمیت بالینی آنها تحت بررسی است.

 
شکل ۳. درخت فیلوژنی کووید-۱۹
 
منبع
رهنمودهای سازمان بهداشت جهانی (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance)
 
 

 

کلیدواژه ها: پاتولوژی مولکولی | سیتوژنتیک | کرونا | کووید19 |



CAPTCHA
دفعات مشاهده: 112 بار   |   دفعات چاپ: 23 بار   |   دفعات ارسال به دیگران: 0 بار   |   0 نظر


کلیه حقوق این وب سایت متعلق به انجمن علمی آسیب شناسی ایران می باشد.           برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق